Відродивши й вдосконаливши колись багатообіцяльний метод, група вчених створила напрочуд високороздільні зображення молекулярної структури білків. Результат може спричинити створення більш проникливих електронних мікроскопів, які відкриють нові перспективи для різних білків, включаючи ключові білки клітинної поверхні, на які націлені розробники ліків.
Чотири десятиліття тому дослідники поспішали одержати зображення білків за допомогою електронних мікроскопів, охолоджених рідким гелієм майже до абсолютного нуля. Вони сподівалися, що екстремальний холод зменшить радіаційне пошкодження, спричинене електронними пучками мікроскопів, що призведе до чіткіших зображень. Але зображення незмінно поверталися більш розмитими, ніж коли машини працювали за вищих температур рідкого азоту. Після багатьох років розчарувань охолодження гелієм було практично припинено. Тепер дослідники в Сполученому Королівстві нарешті з'ясували проблему: нижча температура змушує лід, що оточує білки, згинатися, спотворюючи зображення. І вони вигадали обхідний шлях, щоб запобігти вигину і підвищити роздільну здатність.
«Чудово, що їм удалося змусити це працювати», — каже Пітер Денес, фізик із Національної лабораторії Лоуренса у Берклі. Елспет Гарман, структурний біолог з Оксфордського університету, додає, що покращення роздільної здатності «сприятиме отриманню більш докладної інформації про більші білкові комплекси й дрібніші білкові компоненти в цих комплексах», — каже вона.
Базова техніка, кріогенна електронна мікроскопія (Кріо-ЕМ), візуалізує білкові структури, бомбардуючи зразки потужним пучком електронів і відстежуючи, як ці електрони відскакують від атомів у білку, що дозволяє дослідникам скласти карту початкового положення всіх атомів. Але оскільки ці електронні пучки настільки потужні, вони знищують білки лише за кілька секунд. Заморожування білків у рідкому азоті при 77 градусах Кельвіна знижує це радіаційне пошкодження у п'ять разів у порівнянні з кімнатною температурою, значно підвищуючи роздільну здатність. При температурі рідкого гелію 4 К пошкодження повинні знизитися ще вдвічі. Але це не призвело до покращення зображення. "Зображення завжди були гіршими", - говорить Крістофер Руссо, фізик з Лабораторії молекулярної біології (LMB) Медичної дослідницької ради.
Десятиліттями загальноприйнятим вважалося, що нижчі температури змушують лід, що оточує білки, стискатися, стискаючи атоми всередині. Щоб перевірити, чи так це насправді, Руссо та його колеги відновили у своїй лабораторії 20-річний електронний мікроскоп із рідинним гелієвим охолодженням. В основі машини лежить тонка мідна пластина, пронизана отворами діаметром 400 нанометрів. Зазвичай на цьому етапі дослідники заповнюють кожен отвір розчином, що містить копії досліджуваного білка, а потім заморожують пластину, фіксуючи білки на місці.
Руссо та його колеги почали із заміни білків серією золотих наночастинок, які сильно відхиляють електрони в пучку, що дозволяє відстежувати їхнє положення аж до ангстрема (одна десята нанометра, або діаметр атома водню). Потім вони візуалізували наночастинки при 77 і 13 К, найнижчій температурі, якої їм вдалося досягти за допомогою їх установки. Зображення були нечіткими при нижчій температурі, як і очікувалося, але, відстежуючи невеликі рухи наночастинок, Руссо та його колеги виявили причину: лід у лунках розширився, змусивши його вигнутися вгору та розсунути золоті частинки на додатковий ангстрем. Розмиті зображення, за його словами, є "артефактом того, як зразок утримується у мікроскопі".
В надії зменшити перекошування команда Руссо створила нове налаштування. Вони замінили мідь золотом, яке краще проводить заряджені електрони по краях кожного отвору від зразка, зменшуючи накопичення зарядів, що відштовхують зразки, пояснює Гарман. І вони зменшили отвори у столику до 100 нанометрів. Це зменшило обсяг льоду в кожному отворі, ще більше обмеживши небажані рухи та посиливши фокусування мікроскопа. Потім дослідники додали білки з раніше картованими структурами, щоб подивитися, чи покращать нові зміни роздільну здатність мікроскопа. Зображення двох білків, отримані при 77 К та 13 К, показали покращення приблизно в 1,5 раза, повідомляє команда LMB у Працях Національної академії наук.
"Це велика справа", - каже Денес. Він каже, що це не тільки забезпечить чіткіші деталі білків та інших молекул, отриманих за допомогою кріо-ЕМ, але й має дозволити мікроскопістам отримувати зображення навіть білків приблизно вдвічі менше, ніж це можливо зараз. До них можуть відноситися білки клітинної мембрани, які служать воротарями хімічних повідомлень, що проходять у клітини та з них, що робить їх одними з найцінніших цілей для нових ліків.
Мембранні білки нелегко візуалізувати за допомогою рентгенівської кристалографії, іншої робочої конячки методу візуалізації білків, оскільки вони не збираються у кристали, необхідні для рентгенівської візуалізації. Дефіцит структур мембранних білків також ускладнює інструменти штучного інтелекту для прогнозування структур, які мають бути навчені на відомих структурах, щоб передбачати невідомі. "Їх тисячі просто чекають, коли їх побачать", - каже Руссо.
Очікування може бути недовгим, додає Руссо, виробники кріо-ЕМ вже працюють над тим, щоб їхні машини могли працювати з гелієм і кидати холодніший, більш пильний погляд на білки.
