ДНК складається з довгих ланцюжків, які є кресленням для живих організмів. У генній інженерії вчені розрізають ДНК у певних місцях та з'єднують отримані фрагменти з іншими послідовностями ДНК, що дозволяє використовувати ДНК у таких галузях, як селекція сільськогосподарських культур, лікування генетичних захворювань та створення тваринних моделей для розробки ліків.
Складання коротких фрагментів ДНК вимагає наявності послідовностей, що виступають, відомих як «липкі кінці», для забезпечення ефективного зв'язування. Однак для утворення «липких кінців» потрібне точне розрізання у цільових місцях, що залишається складним завданням при використанні сучасних технологій.
Японська дослідницька група розробила технологію на основі наночастинок срібла для точного розрізання та з'єднання ДНК у цільових місцях, досягнувши у два-п'ять разів більшої ефективності складання ДНК, ніж при використанні традиційних методів за допомогою рестрикційних ферментів. Результати дослідження були опубліковані у журналі Nucleic Acids Research.
Обмеження наявних методів
Традиційне складання довгих ланцюжків ДНК використовує рестрикційні ферменти для розрізання ДНК та ДНК-лігази Т4 для повторного з'єднання фрагментів. Проте рестрикційні ферменти розрізають лише певні послідовності та утворюють «липкі кінці», які часто занадто короткі, що обмежує ефективність сполуки.
Для розв'язання цієї проблеми дослідна група під керівництвом професора Хіроші Абе та доцента Масахіто Інагакі з Університету Нагоя у співпраці з професором Нацухісою Ока з Університету Гіфу вивчила розщеплення ДНК у цільових ділянках з використанням хімічних реакцій замість рестрикційних ферментів.
Дослідники вивчили реакцію, описану в період з 1990 по 1992 рік, в якій іони срібла розщеплюють ДНК, модифіковану 3'-тіольними групами, у певних ділянках. Вони оцінили її потенціал для створення відповідних «липких» кінців. Результати показали, що хоча іони срібла ефективно розщеплюють ДНК, вони також зв'язуються неспецифічно, що призводить до осадження. Це призвело до низького ступеня отримання ДНК — близько 14%, що недостатньо для практичного застосування.
Як наночастинки покращили розщеплення
Потім команда використовувала наночастинки срібла, припустивши, що їх можна видалити після реакції центрифугування, що потенційно збільшить ступінь вилучення ДНК.
Експерименти показали, що ефективність розщеплення ДНК досягала приблизно 50% при 70°C (158°F) і майже 100% при 95°C (203°F) протягом двох годин. Однак такі високі температури становлять ризик пошкодження довголанцюгової ДНК.
Для розв'язання цієї проблеми команда покрила наночастинки поліетиленгліколем (ПЕГ), водорозчинним полімером, для підвищення стабільності та дисперсії. Ця модифікація збільшила ефективність розщеплення з 36% без ПЕГ до 92% ПЕГ при 37°C (99°F) протягом 31 години.
"У результаті ми оптимізували умови до практичного рівня і за кімнатної температури досягли ефективності розщеплення за допомогою ПЕГ вище 91% при 50°C (122°F) всього за одну-дві години", - сказав Інагакі, головний автор дослідження.
Додатковою перевагою цього процесу стало видалення небажаних фрагментів ДНК, пов'язаних з поверхнею наночастинок, в результаті чого в розчині залишалися бажані фрагменти з липкими кінцями. Цей процес очищення збільшив кінцевий рівень вилучення ДНК з 14% до 98%.
Більш міцне з'єднання та перспективи застосування
Використання наночастинок срібла також дозволило одержати фрагменти ДНК з липкими кінцями довжиною 8 основ, що є складним завданням при використанні звичайних рестрикційних ферментів. Застосовуючи ДНК-лігазу Т4 для з'єднання цих фрагментів, команда досягла приблизно вдвічі більшої ефективності з'єднання в порівнянні з традиційними методами.
При використанні 18-основного виступу ефективність сполуки досягла 44%, порівняно з 8% при використанні звичайного 4-основного виступу, що являє собою п'ятикратне поліпшення.
Для оцінки практичного застосування цього підходу дослідники зібрали фрагмент ДНК, що кодує зелений флуоресцентний білок (GFP), і ввели його в клітини HeLa людини. Вони успішно підтвердили експресію GFP, що вказує на точне складання.
Інагакі сказав: "Ми вважаємо, що ця технологія буде корисною для синтезу геномної ДНК, з безліччю можливих застосувань у таких галузях, як створення бібліотек мРНК для протиракових вакцин та генної терапії, а також розробка штучних білкових ліків та геномних культур".
Він також пояснив наступний крок: "Ми показали, що два фрагменти ДНК можуть бути з'єднані. Тепер нам потрібно підтвердити, чи можна поєднувати кілька фрагментів одночасно — це є ключовим кроком для створення ДНК геномного масштабу".
